静安植物组培实验怎么做（植物组培室）

完整植物组织培养程般包括几步骤： （1）准备阶段 查阅相关文献根据已功培养相近植物资料结合实际制订切实行培养案根据实验案配制适化消毒剂及同培养阶段所需培养基并经高压灭菌或滤除菌备用 （2）外植体选择与消毒 选择合适部位作外植体采经适预处理进行消毒处理消毒外植体菌条件切割定块或剥离茎尖挑花药接种初代培养基 （3）初代培养 接种材料置于培养室或光照培养箱培养促使外植体已化细胞脱化形愈伤组织或顶芽、腋芽直接萌发形芽愈伤组织转移化培养基化同器官原基或形胚状体发育形再植株 （4）继代培养 化形芽、原球茎数量限采用适继代培养基经切割转接芽苗繁殖定数量再部用于壮苗根另部保存或继续扩繁进行脱毒苗培养需提前进行病毒检测 （5）根培养 刚形芽苗往往比较弱数根降低细胞裂素浓度或加提高素浓度促进苗根提高其健壮度 （6）炼苗移栽     选择健壮根苗进行室外炼苗待苗适应外部环境再移栽疏松透气基质注意保温、保湿、遮荫防止病虫危害组培苗完全并定即移向田用于产 ：茎尖→表面消毒→接种诱导培养基→茎尖→病毒检测鉴定→培养根植株→培养根→完整植株→炼苗20-25→移栽  规情况详细产流程图：   图" class="ikqb_img_alink" 同品种词流程略差异进行树育苗需进行嫁接等操作流程组培工厂化育苗言般根据面流程图安排各项作业相互衔接、配合才能提高产效益  

植物组织培养的流程

植物组织培养的流程：

第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。

流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。

有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1～2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。

无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08～0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。

扩展资料

培养材料采集：

要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合作用、呼吸作用旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。

培养材料的消毒：

从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。

参考资料：植物组织培养_百度百科

组织培养的步骤

一、培养基配制

配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

1、配制几种母液

（1）配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取

NH4NO3 165g KH2PO4 17g

KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g

MgSO4·7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取

KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g

MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g

ZnSO4·7H2O 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取

CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g

各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取

肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g

烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液

一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取

EDTA二钠 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2、配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。

（2）分别取上面八种母液10ml倒入。

（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。

（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

（8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

就像我们可以把核酸提取这样一类分子生物学实验粗暴地划分成细胞裂解和核酸纯化两个步骤一样，植物组织培养也有两个核心的步骤，那就是野生材料驯化和组织形态建成。

野生材料的驯化

很多时候，需要使用植物组织培养往往是出于遗传转化受体的需要，抑或是进行不同条件的培养以提取代谢物进行差异分析，出于这样的前提，实验者往往只是搬照文献里给出的培养条件或者做出明确的改动，缺乏的只是材料。

因此，无菌培养是这一类组织培养实验的保障，而将野生材料驯化的过程，即是无菌操作与外植体消毒等一系列与污染作斗争的集中体现。

野生材料驯化的具体措施如下：

1. 灭菌：

通常，我们需要对使用的培养基、培养皿、镊子、解剖刀、去离子水和滤纸进行彻底的灭菌，这样可以彻底杀死器材和培养基中的微生物；

其中，培养基、镊子、解剖刀、去离子水等液体和金属器皿通常采用121℃ 20-30min的湿热灭菌法，玻璃器皿常用180℃ 2h的干热灭菌法，而抗生素、激素等不耐高温的试剂常用过滤灭菌法。

2. 消毒：

消毒是指外植体和操作台面的消毒，目的是在不伤害植物的前提下，抑制和杀死大部分微生物。其中，外植体消毒的方式主要分为表面消毒和侵入消毒两种，对于操作台面的消毒通常是指超净工作台使用前进行的的30min紫外灯消毒和操作过程中的空气滤过消毒，值得一提的是，在使用超净台之前用70 % 酒精擦拭台面会有一定效果。

对于大部分种子、陆生植物的茎叶等，表面消毒足以杀死可能会在组织培养过程中导致污染的微生物，比如70 % 乙醇、5 % 过氧化氢，均可以在短时间内有效杀死表面的微生物；

但对于一些生长在潮湿阴暗环境中的植物来说，通常有着大量的组织内生菌，而这些内生菌往往不是表面消毒可以杀死的，一些侵入式消毒剂会比较有效，如升汞、次氯酸钠等。

3. 无菌操作：

无菌操作即杜绝一切来自操作者的污染或因操作者失误导致的其他污染，一些常见的操作手法如下：

a) 设立单独的组培间，并设立与外界污染区的缓冲间，在缓冲间内更衣进入组培间；

b) 进入组培间前要在缓冲间内进行全身的酒精喷雾消毒，同时换上组培室专用拖鞋；

c) 操作过程中，佩戴手套或肢体不从一切开口器皿的上方经过；

d) 器皿不要遮盖超净台出风口，超净台不要开口太大；

e) 在超净台中点燃酒精灯，操作尽量在酒精灯火焰周围进行；

f) 使用的金属工具和玻璃器皿每进行一阶段的操作后及时进行灼烧灭菌；

g) 镊子、枪头等接触培养基的工具在接触到其他固态表面后立即灼烧灭菌或更换；

h) 做其他分子实验的超净台应与进行组织培养接种的超净台分开；

（1）器具的消毒。组培前玻璃器皿等要用洗衣粉刷洗干净备用。接种室和超净工作台用70%酒精擦洗，并用紫外光照射。其他用具也要进行高温消毒。

（2）培养材料的采集。组培所用的植物材料可采用根、茎、叶、花、芽及种子的子叶、胚轴的一部分，有时也可利用花粉或花药。通常应取初生幼嫩的材料，这些材料在移入培养基时都必须保持鲜嫩状态，否则组培将会失败。

（3）培养材料的消毒。先将采集来的材料用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用无菌纱布将材料上的水分吸干，切成小块，放入70%酒精中浸泡15～30秒，再用30%漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒，最后用无菌水冲洗3～5遍。

（4）制备外植体。将上述经过灭菌的材料，用在火焰上消过毒的刀、剪、镊，在消毒滤纸上剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮和种皮胚乳等，然后切成长0.2～0.5厘米的小片（这些小片就是外植体）。在操作过程中，严禁用手触动这些材料。

（5）接种培养。在无菌条件下将切好的外植体立即接种在培养基上。接种后所用试管和三角瓶都要用无菌药棉封口，放培养室培养架上培养。每天用日光灯照12～16小时。保持在25℃±20℃。也可采用变温培养，夜间温度略低于白天。

植物组织培养可以分为四个阶段：

（1）建立无菌体系，即外植体及培养基的消毒、接种，获得愈伤组织或器官。

（2）进行增殖，不断分化产生新的植株，或直接产生不定芽及胚状体，也可以根据需要反复进行继代培养，以达到大量繁殖的目的。

（3）将植株转移进行生根培养，可以转入生根培养基，也可以直接切取进行扦插生根。

（4）试管苗过渡，即试管苗出瓶后进行一定时间对外界环境的适应过程。

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